آزمایش غربالگری بین روز سوم ( پس از ۷۲ ساعت تغذیه با شیر مادر) تا روز پنجم بعد از تولد ( در صورتی که نوزاد به اندازه کافی با شیر تغذیه شده باشد) صورت می‌گیرد.

برای انجام آزمایش غربالگری، قطره‌ای ازخون پاشنه پای نوزاد (با شرایطی که در مجموعه استانداردهای آزمایشگاهی برنامه PKU در دستورالعمل کشوری برنامه ذکر شده است)، بر روی کاغذ فیلتر گرفته می‌شود و به روش رنگ سنجی (جزئیات روش در متن استانداردهای تشخیص آزمایشگاهی در برنامه کنترل PKU آمده است)، مقدار PHE تعیین می شود.

در صورتی که از نوزاد قبل از گذشت ۴۸ ساعت از عمر خونگیری شود و یا به هر دلیل در زمان خونگیری تغذیه کافی با شیر نشده باشد، آزمایش بصورت کاذب، منفی می شود. در این شرایط باید در زمانی که نوزاد به مدت ۷۲ ساعت از شیر تغذیه شده باشد، خونگیری و آزمایش، مجدداً تکرار شود.

در حالاتی نظیر بیماری‌های کبد، نارسی نوزاد، ابتلای مادر به PKU، هیپرالیمانتاسیون، آزمایش غربالگری می‌تواند بصورت کاذب مثبت شود.

نکته: همچنین اشکالات تکنیکی می تواند بصورت کاذب منجر به مثبت یا منفی شدن آزمایش غربالگری نوزاد شود. در این موارد نیز باید نمونه گیری و آزمایش غربالگری تکرار و نتایج مجدداً ارزیابی شود.